| 肺癌患者肺组织DNA
加合物的检测及其影响因素
唐山工人医院 张 志1 张雪梅2 杨文敏3 付占昭1
中图分类号：R734.2；Q503
摘要： 目的 探讨肺癌患者肺组织中的DNA加合物含量及其影响因素。方法 采用32P后标记法检测34例肺癌组织中DNA加合物的含量。结果
吸烟组患者肺癌组织中的DNA加合物含量显著高于非吸烟组（P<0.05）；不同年龄、性别的患者肺癌组织中的DNA加合物含量无显著性差异。肺癌组织加合物含量与肺癌组织学类型、分化程度和淋巴结转移状态均有密切关系。结论
吸烟可导致肺癌患者肺组织中DNA加合物水平增加。DNA加合物水平有可能作为一项判断肺癌恶性程度的指标。
关键词：肺癌 DNA加合物 吸烟 32P后标记法
Abstract: Objective：This study aimed to detect DNA adduct
in tumor tissues and analysis the factors influencing formation
of DNA adduct. Methods: DNA was extracted from the tumor tissues
derived from 34 patients with lung cancer. DNA adducts were
analyzed using 32P-postlabelling method with P1 nuclear modification.
Results: 1、DNA adduct levels were significantly higher in
smoking patients than in non-smoking patients（P<0.05）.
2、 The correlation between age or sexes and the levels of
DNA adduct in lung tumor tissues was not found. 3、 DNA adduct
levels is related to pathological characteristics (the histological
types 、degree of differentiation and lymph node metastasis
of lung cancer). Conclusion: smoking played a strong role
in formation of DNA adduct. DNA adduct levels can be used
as a potential marker to estimate malignant degree for lung
cancer.
Key Words： lung cancer DNA adduct Smoking 32P-postlabelling
method
肺癌的发病率及死亡率在世界范围内呈继续上升趋势，大量的流行病学研究发现吸烟是肺癌的主要病因之一，并证实吸烟量与患肺癌危险性之间存在线性关系[1、2
]，但仍有待于找到其分子水平上的关系。核酸酶P1富集的32P-后标记技术[3]是八十年代后期发展起来的一种方法简单、灵敏度高的新兴技术，其灵敏度可达1个加合物／1010个核苷酸水平。此方法可适用于人体组织样本的单一性及混合性致癌物－DNA加合物的分析，对已知或未知的DNA－加合物都可用32P后标记法检测。
本实验采用32P－后标记法，检测肺癌组织标本中的DNA加合物，通过对吸烟等污染—肺组织DNA加合物—肺癌三者之间关系的分析，从而在分子水平上研究环境污染的致癌机理，旨在为肺癌的防治提供科学依据，同时也为未来进行大规模的分子流行病学研究提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 组织样本采集
肺癌组织样本采自山西省肿瘤医院胸外科住院肺癌患者。根据事先制定的调查表，详细询问并记录患者的资料，如姓名、年龄、居住地址、职业史及其有关的暴露史、吸烟史、家族癌症史、既往肺部疾患史、以及燃煤类型、烹调方式等。
取新鲜肺癌组织约1cm×1cm×1cm放入液氮中低温保存，在中国医学科学院进行DNA加合物的测定。标本其余部分送交山西省肿瘤医院病理科，按1984年世界卫生组织规定的肺癌类型标准分型，并进一步判定细胞分化程度和有无淋巴结转移。
1.2 DNA的提取及加合物的检测
a) DNA的提取：使用酚——氯仿抽提法[4、5]。
b) DNA加合物的含量测定：使用核酸酶P1介导的32P-后标记法 [6]。
c) 加合物标记值（Relative Adduct Labeling Value ,RAL）： 含义为每108核苷酸中所含加合物数。
1.3 统计分析：使用SPSS 7.5统计软件进行分析。 性别、年龄、吸烟对肺组织 DNA加合物含量的影响使用t检验，不同烟龄与DNA加合物水平的关系研究使用相关分析；肺癌组织DNA加合物含量与肺癌病理学特征关系分析使用F检验。
2 结果
2.1 病例的基本情况
自1998年7月至1999年4月共收集41例肺癌患者肺标本，合格者34例。其中，性别：男22例，女12例。年龄：55.8±11.4岁。居住地：市区24人，农村10人。吸烟：男性13例，女性4例。肺癌类型构成：鳞癌20例，腺癌9例，小细胞癌5例。
2.2 RAL量与年龄、性别、吸烟等因素的关系：
吸烟可明显增加肺组织DNA加合物的含量（t=2.396,p<0.05），且DNA加合物的含量与烟龄成正相关（r=0.4828,t=2.135,p<0.05）。
对不吸烟患者样本的线性回归分析显示，年龄与人肺组织DNA加合物的含量无相关性。(Y=0.021x-0.168,r=0.267,
P>0.05)。
对吸烟组与不吸烟组患者样本的分析表明，男女之间DNA加合物含量差异无显著性（表1）。
表1、性别对人肺组织DNA加合物含量的影响
Group |
N |
RAL |
t Value |
P Value |
Smoker |
|
|
|
|
Male |
13 |
2.147±1.345 |
1.464 |
>0.05 |
Female |
4 |
1.084±0.908 |
No-smoker |
|
|
|
|
Male |
9 |
0.879±0.979 |
0.329 |
>0.05 |
Female |
8 |
1.036±0.986 |
2.3 RAL量与肺癌病理学特征的关系：
RAL在不同组织学类型中，鳞癌高于腺癌，差异有显著性； RAL在肺癌的不同分化程度之间，差异有显著性；RAL在淋巴结转移与否，差异有显著性（表2）。
表2、肺癌组织DNA加合物含量与肺癌病理学特征的关系
Pathological characteristics
|
n |
RAL(×10-8) |
F Value |
P Value
|
Histological |
|
|
|
|
Squamous cell carcimoma |
20 |
2.02 |
4.99 |
<0.05 |
Adenocarcinoma |
9 |
0.78 |
Small cell cancer |
5 |
0.11 |
Degree of differentiation |
|
|
|
|
High |
14 |
0.20 |
3.41 |
<0.05 |
Middle |
11 |
0.94 |
low |
9 |
2.57 |
Lymphaden metastasis
|
|
|
|
|
Positive |
14 |
2.43 |
8.68 |
<0.01 |
negative |
20 |
0.70 |
讨论：
大量宏观流行病学研究发现，吸烟、大气污染等是肺癌的主要病因之一。但受限于实验技术、人体肺组织样本采集困难等因素，目前尚难以在分子水平上找到更直接的证据，从而揭示其分子致癌机制。32P后标记薄层层析技术是国际上80年代后期兴起的一项灵敏度高、重现性好的技术，适用于各种人体组织样本的测定。本试验采用此项技术检测致癌物在靶器官中分子水平上的暴露剂量。结果提示,肺组织中DNA加合物的含量不受性别、年龄的影响；而吸烟可明显增加肺组织中DNA加合物的含量，且与烟龄成正相关。这从分子水平上再次证明了一个无可辩驳的事实，吸烟可致肺癌。香烟中含有许多能与DNA反应形成加合物的致癌物质[7
]。致癌物进入人体后直接或经过代谢形成亲电基团，可与肺组织靶器官DNA反应，形成DNA加合物，从而激活癌基因，引起正常细胞的恶性转化。因此，吸烟可明显增加基因突变的可能性和肺癌发生的危险性。我们还发现，鳞癌患者RAL显著高于腺癌患者。这与鳞癌患者吸烟率高于腺癌患者吸烟率这一现象相平行，也从另一侧面也说明了吸烟在肺癌发生中所扮演的重要角色。此外，RAL量在不同分化程度和淋巴结转移状态组间也存在显著性差异，提示RAL有可能作为一项判断肺癌恶性程度的独立指标。
总之，本试验不仅从分子水平上证实了吸烟是肺癌的危险因素，而且对于DNA加合物作为新的肺癌肿瘤标志物的可行性进行了探索。但是，由于正常人肺组织标本很难获得，肺癌组织DNA加合物的分析缺乏正常对照。为此，今后将致力于寻找一种取材更为方便的组织（如血液）替代肺组织，进行DNA加合物分析，这将从很大程度上提高DNA加合物作为肿瘤标记物的可行性。
参考文献
1. 王陇德，Jaylubin，张淑蓉等. 吸烟环境与肺癌关系研究. 中国预防医学杂志. 2002；3（1）：3-7.
2. Gupta RC,Reddy MV et al. Carcinogeresis,1982;3(9):1081
3. Reddy M V , Gupta RC, Randerath E, et al. 32P-Postlabing
test for covalent DNA binding of chemicals in vivo Application
to a variety of aromatic carcinogens and methylating agents
Carcinogenesis,1984;5(2):231-243
4. Gupta R C , Earley K and Sharma S,et al . Use of human
peripheral blood lymphocytes to measure DNA binding capoicity
of chemical carcinogens. Proc . Natl. Acad. Sci. USA, 1988;
85; 3513-3517
5. 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 第二版. 北京：中国协和医科大学出版社，1999年，61.
6. 张雪梅，杨文敏，张志. 大气颗粒有机提取物所致小鼠DNA加合物与微核的相关关系研究. 中国公共卫生，2001，17（1）：11.
7. 袭著草，晁福寰，孙咏梅. 香烟侧流烟雾引起的DNA分子氧化损伤. 环境与健康杂志. 2002；19（1）：29-31.
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